Nowy mechanizm oporności Giardia na albendazol – przełomowe odkrycie

Dlaczego Giardia staje się oporna?

Oporność na albendazol u Giardia duodenalis – odkryto nowy mechanizm molekularny

Giardia duodenalis to powszechny pasożyt jelitowy wywołujący giardiozę – chorobę, która dotyka ponad 280 milionów osób rocznie na całym świecie. Standardowe leczenie opiera się głównie na pochodnych 5-nitroimidazolu (np. metronidazolu) oraz benzimidazolu (np. albendazolu). Albendazol (ABZ) zyskał popularność jako skuteczna, tania alternatywa dla metronidazolu, powodująca mniej działań niepożądanych. Jest on szeroko stosowany w kampaniach odrobaczania w regionach endemicznych Afryki, Azji i Ameryki Łacińskiej. Jednakże, stosowanie suboptymalnych dawek tego leku w celu zapobiegania infekcjom pasożytniczym może wiązać się z rozwojem szczepów opornych, co stanowi coraz poważniejszy problem zdrowotny.

Czy sirtuiny to nowe ogniwo w mechanizmie oporności?

Najnowsze badania przeprowadzone przez zespół naukowców pod kierownictwem Adriána Cháveza-Cano rzucają nowe światło na molekularne mechanizmy odpowiedzialne za oporność Giardia duodenalis na albendazol. Badacze zidentyfikowali kluczową rolę enzymów zwanych sirtuinami w rozwoju tej oporności. “Nasze wyniki sugerują, że sirtuiny w Giardia, szczególnie gdSir2.1 i gdSir2.3, odgrywają istotną rolę w oporności na albendazol poprzez mechanizmy regulacji stresu oksydacyjnego” – piszą autorzy badania.

Sirtuiny to NAD⁺-zależne deacetylazy histonowe, które regulują kluczowe szlaki sygnałowe zaangażowane w liczne procesy biologiczne. Wykazano, że zmieniają one swoją ekspresję i aktywność w warunkach zapalnych, gdy dochodzi do wzrostu reaktywnych form tlenu (ROS). W komórkach ludzkich zidentyfikowano siedem homologów drożdżowego Sir2, nazwanych SIRT1 do SIRT7. Mogą one modulować ekspresję i aktywację innych enzymów, przyczyniając się do odpowiedzi organizmu na stres.

W badaniu wykorzystano trofozoity Giardia duodenalis szczepu WBC6 oraz linie oporne na ABZ (R1.35, R8 i R250), które uzyskano poprzez hodowlę w obecności wzrastających stężeń albendazolu. Do wyciszenia ekspresji poszczególnych sirtuin zastosowano nowoczesną technikę CRISPRi (CRISPR interference), projektując specyficzne gRNA przeciwko regionom kodującym pięciu sirtuin Giardia (gdSir1.1, gdSir2.2, gdSir2.3, gdSir2.4, gdSir2.5). Skuteczność wyciszenia potwierdzono za pomocą RT-qPCR, Western blot (badanie acetylacji histonów) oraz testów encystacji.

Jak wpływa redukcja sirtuin na wrażliwość pasożyta?

Badacze zaobserwowali, że linie Giardia oporne na albendazol wykazują zwiększoną ekspresję gdSir2.1 i gdSir2.3 oraz podwyższone poziomy NAD⁺, co sugeruje zwiększoną aktywność tych enzymów. Ekspresja gdSir2.1 była zwiększona w liniach R1.35 i R250 (odpowiednio 2,99 i 3,06-krotnie), podczas gdy ekspresja gdSir2.3 była zwiększona w porównaniu do szczepu dzikiego (WB) tylko w linii R1.35 (3,19-krotnie). Wszystkie trzy linie oporne wykazywały wyższe stężenie NAD⁺ w porównaniu do kontroli, co wskazuje, że aktywność sirtuin może być zwiększona w liniach opornych na ABZ.

Aby dokładniej zbadać rolę sirtuin w oporności na ABZ, zespół zastosował technikę CRISPRi do selektywnego wyciszenia ekspresji poszczególnych sirtuin. Wyniki były jednoznaczne – komórki z obniżoną ekspresją gdSir2.1 i gdSir2.3 wykazywały znacznie większą wrażliwość na albendazol oraz nadtlenek wodoru (H₂O₂). Knockdowny gdSir2.1 i gdSir2.3 były odpowiednio o 41% i 24% bardziej podatne na ABZ oraz o 51% i 63% bardziej podatne na nadtlenek wodoru. Oba enzymy wydają się odgrywać kluczową rolę w kontroli stresu oksydacyjnego, ponieważ ich downregulacja wykazała 68% redukcję żywotności w porównaniu do kontroli przy stężeniu H₂O₂ wynoszącym 250 μM.

Co istotne, wyciszenie ekspresji sirtuin prowadziło do zwiększonej produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) podczas leczenia albendazolem. Szczególnie wyraźne było to w przypadku gdSir2.3, którego downregulacja zwiększała wewnątrzkomórkowe poziomy ROS o 43% w porównaniu do kontroli. Podobne wyniki zaobserwowano podczas traktowania H₂O₂, gdzie downregulacja gdSir2.1 i gdSir2.3 zwiększała produkcję ROS o 8,53-11,99%. Dane te potwierdzają, że obie sirtuiny zapewniają pasożytowi ochronę przed stresem oksydacyjnym.

Czy inhibitory sirtuin mogą przywrócić skuteczność leczenia?

Czy możliwe jest przełamanie tej oporności? Badacze sprawdzili, jak inhibitory deacetylaz histonowych wpływają na żywotność opornych linii Giardia. Najpierw określili wartości IC₅₀ dla inhibitorów HDAC – maślanu sodu i nikotynamidu – na wrażliwym szczepie (WB). Wartości IC₅₀ dla maślanu sodu wynosiły 23 i 25,7 mM, a dla nikotynamidu 3,9 i 2,5 mM odpowiednio po 24 i 48 godzinach. Na podstawie tych wyników wybrano 24-godzinne leczenie 10 mM maślanem sodu i 2 mM nikotynamidem do dalszych badań. Stwierdzili, że nikotynamid (inhibitor sirtuin) znacząco zmniejsza żywotność opornych linii w obecności albendazolu. Efekt ten był szczególnie widoczny w linii R250, co potwierdza udział sirtuin w mechanizmie oporności.

Kolejnym istotnym odkryciem było to, że downregulacja sirtuin zwiększała poziom uszkodzeń DNA indukowanych stresem oksydacyjnym, co potwierdzono poprzez wykrycie markera 8OHdG. Nawet w warunkach podstawowych, bez dodatkowego traktowania, szczepy z wyciszonymi sirtuinami wykazywały zwiększony poziom uszkodzeń DNA w porównaniu do szczepów dzikich. W badaniach dot-blot, gdSir2.1 i gdSir2.3 wykazały odpowiednio 1,8 i 2,9-krotny wzrost markera 8OHdG. Wskazuje to, że sirtuiny w Giardia są silnie powiązane z naprawą uszkodzeń DNA, podobnie jak ma to miejsce u wyższych organizmów i innych pasożytów.

Badanie ujawniło również, że sirtuiny modulują ekspresję genów odpowiedzi na stres oksydacyjny. Downregulacja gdSir2.1 zmniejszała ekspresję tioredoksyny reduktazy (Trx), peroksyredoksyny (Prx) i reduktazy nadtlenkowej (SOR), podczas gdy downregulacja gdSir2.3 zmniejszała ekspresję białka flawodiironowego (Fdp), peroksyredoksyny i oksydazy NADH. Wyniki te korelują z wcześniejszymi doniesieniami, gdzie Prx, Fdp i oksydaza NADH miały zwiększoną ekspresję w liniach opornych na ABZ.

Warto zauważyć, że oba enzymy wydają się mieć wspólne geny docelowe, takie jak tioredoksyna reduktaza (Trx) i peroksyredoksyna (Prx). Tioredoksyna reduktaza (Trx) redukuje tioredoksynę, a peroksyredoksyna (Prx) wykorzystuje zredukowaną formę tioredoksyny do przekształcenia H₂O₂ w H₂O. Ponieważ niektóre z enzymów antyoksydacyjnych w Giardia wykorzystują NADH jako kofaktor bezpośrednio (oksydaza NADH, DT-diaforaza, reduktaza rubredoksyny, NR1 i NR2) lub pośrednio (białko flawodiironowe i SOR), badacze sugerują, że nadmierna aktywacja systemu antyoksydacyjnego podczas leczenia ABZ może powodować zwiększone poziomy NAD⁺ zaobserwowane w tym badaniu.

Innym interesującym aspektem relacji między sirtuinami a regulacją enzymów antyoksydacyjnych może być ich lokalizacja subkomórkowa. W przypadku sirtuin Giardia, gdSir1 jest cytoplazmatyczna, gdSir2.2 i gdSir2.3 znajdują się na obwodzie jądra, gdSir2.4 lokalizuje się w jądrach, a gdSir5 ma lokalizację jąderkową. Fakt, że cytoplazmatyczna gdSir2.1 wykazuje zwiększoną ekspresję w liniach R1.35 i R50 jest zgodny z jej prawdopodobną interakcją z enzymami antyoksydacyjnymi, które są rozproszone w cytoplazmie Giardia.

Jakie szanse na nowe strategie terapeutyczne daje ten raport?

Jakie są implikacje kliniczne tych odkryć? Przede wszystkim, badanie to otwiera nowe możliwości terapeutyczne w leczeniu giardiozy, szczególnie w przypadkach oporności na standardowe leczenie. Inhibitory sirtuin mogłyby potencjalnie służyć jako adiuwanty w terapii albendazolem, zwiększając jego skuteczność. Czy inhibitory sirtuin znajdą zastosowanie w praktyce klinicznej jako uzupełnienie standardowej terapii przeciwpasożytniczej? Odpowiedź na to pytanie wymaga dalszych badań, ale obecne wyniki są obiecujące.

Warto podkreślić, że oporność na leki u Giardia jest procesem wieloczynnikowym, w którym ten sam fenotyp oporności może wynikać z różnych mechanizmów prowadzących ostatecznie do podobnych rezultatów. W miarę wzrostu stężenia leku, Giardia może angażować dodatkowe mechanizmy, takie jak mutacje genetyczne, aktywność transporterów leków czy modyfikacje epigenetyczne. Razem te adaptacje umożliwiają pasożytowi przeżycie przy stężeniach albendazolu tak wysokich jak 250 μM.

Badanie to stanowi pierwszy raport łączący sirtuiny, oporność na leki i stres oksydacyjny u Giardia duodenalis. Lepsze zrozumienie tych mechanizmów może przyczynić się do opracowania bardziej skutecznych strategii leczenia giardiozy, szczególnie w regionach endemicznych, gdzie oporność na leki stanowi rosnący problem zdrowia publicznego.

Podsumowanie

Najnowsze badania ujawniły istotną rolę enzymów zwanych sirtuinami w rozwoju oporności Giardia duodenalis na albendazol. Szczególnie dwa enzymy – gdSir2.1 i gdSir2.3 – wykazują zwiększoną ekspresję w szczepach opornych na lek. Sirtuiny te chronią pasożyta przed stresem oksydacyjnym i uszkodzeniami DNA, regulując ekspresję genów odpowiedzialnych za odpowiedź antyoksydacyjną. Wyciszenie ekspresji tych enzymów znacząco zwiększa wrażliwość pasożyta na albendazol. Badania wykazały również, że inhibitory sirtuin, takie jak nikotynamid, mogą przywracać skuteczność albendazolu w szczepach opornych. To pierwsze badanie łączące sirtuiny z opornością na leki i stresem oksydacyjnym u Giardia duodenalis, otwierające nowe możliwości terapeutyczne w leczeniu giardiozy.