Przełom w badaniach nad opornością pasożytów na leki przeciwrobacze

Czy nowe metody transcryptomowe rzucą światło na oporność?

Badanie transcryptomowe przeprowadzone na opornych i wrażliwych szczepach Haemonchus contortus pozwoliło zidentyfikować geny związane z opornością na albendazol u tego pasożytniczego nicienia. H. contortus jest poważnym patogenem małych przeżuwaczy, powodującym postępującą utratę masy ciała, bladość błon śluzowych i obrzęk żuchwy, a w ciężkich przypadkach prowadzącym do śmierci zwierzęcia z powodu skrajnego osłabienia i niedożywienia.

W badaniu wykorzystano model eksperymentalny oparty na zakażeniu owiec larwami L3 opornego na albendazol szczepu H. contortus. Szczep ten charakteryzował się początkową liczbą jaj w kale wynoszącą 3600 EPG, redukcją liczby jaj w kale (FECR) na poziomie 13,8% oraz wartością EC₅₀ wynoszącą 1,28 μg/ml, co potwierdzało jego oporność na albendazol. Do badań wykorzystano ośmiomiesięczne owce, które po przetransportowaniu na teren Kolegium Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Rolniczego Mongolii Wewnętrznej, zostały poddane leczeniu klozantelem sodowym. Po potwierdzeniu braku pasożytów, zwierzęta zakażono eksperymentalnie 8000 larwami L3 opornego szczepu.

Czy szlak cGMP i RNAi odsłaniają mechanizmy oporności?

Analiza różnicowej ekspresji genów wykazała, że szlak sygnalizacyjny cGMP zawierał największy odsetek genów różnicowo ekspresjonowanych (23 z 54) związanych z fazą dauer, stanem fizjologicznym umożliwiającym nicieniom przetrwanie niekorzystnych warunków środowiskowych. Wśród zidentyfikowanych genów, GCY-12 wykazywał najwyższy poziom nadekspresji (log₂Foldchange = 9,61, p < 0,05) w szczepach opornych w porównaniu do wrażliwych. Gen ten koduje receptorową cyklazę guanylową, katalizującą konwersję guanylanu do cyklicznego guanylanu, aktywując szlak sygnalizacyjny zależny od cGMP. Analiza funkcjonalna wykazała, że gen ten był również istotnie wzbogacony w ośmiu innych szlakach sygnalizacyjnych, w tym szlaku sygnalizacyjnym cAMP, syntezie i wydzielaniu aldosteronu, wydzielaniu reniny i metabolizmie puryn.

W celu weryfikacji roli genu GCY-12 w oporności na albendazol, zastosowano technikę interferencji RNA (RNAi) do wyciszenia jego ekspresji w jajach i larwach L3 H. contortus. Zaprojektowano trzy siRNA specyficzne dla GCY-12 oraz kontrolne niespecyficzne siRNA (NC siRNA). Sekwencje siRNA zostały zaprojektowane zgodnie ze standardowymi zasadami: sekwencje docelowe wybrano głównie w regionie CDS, nici sensowne i antysensowne miały długość 19-21 nukleotydów, a zawartość GC wynosiła od 30% do 60%. Zoptymalizowano warunki eksperymentalne, testując pięć gradientów temperaturowych (4°C, 8°C, 12°C, 16°C i 20°C) i ustalając temperaturę 12°C jako optymalną dla interferencji RNA w jajach pasożyta, co pozwoliło utrzymać je w stadium moruli.

Czy wyciszenie GCY-12 przywraca skuteczność albendazolu?

Wyniki analizy qRT-PCR wykazały skuteczne wyciszenie genu GCY-12, z redukcją ekspresji o 59-64% w larwach L3 i 26-34% w jajach w porównaniu do grup kontrolnych. Spośród trzech zaprojektowanych siRNA, siRNA1 skierowane na pozycję 870 wykazało najsilniejszy efekt wyciszający i zostało wybrane do dalszych eksperymentów. Co istotne, test hamowania wylęgania jaj (EHA) przeprowadzony po wyciszeniu genu GCY-12 wykazał znaczący spadek wartości EC₅₀ z 118,24 μg/ml (grupa kontrolna PBS) i 110,06 μg/ml (grupa kontrolna NC) do 34,45 μg/ml w grupie z wyciszonym genem GCY-12 (p < 0,0001), co odpowiada redukcji EC₅₀ o 70,86%.

Uzyskane wyniki sugerują, że gen GCY-12 odgrywa istotną rolę w oporności H. contortus na albendazol poprzez mechanizmy związane ze szlakiem sygnalizacyjnym cGMP. W przeciwieństwie do klasycznych mechanizmów oporności, takich jak mutacje w genie β-tubuliny (w pozycjach 167, 198 i 200) czy aktywność transporterów ABC, GCY-12 wpływa na oporność poprzez zmiany w poziomie ekspresji i odrębny mechanizm związany ze szlakiem sygnałowym cGMP. Jednym z możliwych mechanizmów jest to, że GCY-12 zwiększa odporność pasożyta na niekorzystne warunki poprzez aktywację mechanizmów odpowiedzi na stres, umożliwiając H. contortus wytrzymanie uszkodzeń wywołanych przez leki. Wyciszenie GCY-12 może osłabiać te mechanizmy ochronne, czyniąc pasożyta bardziej podatnym na działanie albendazolu.

Jak nowe odkrycia mogą zmienić strategię kontroli pasożytów?

Warto zauważyć, że mimo zwiększonej wrażliwości jaj poddanych RNAi na albendazol, pozostawały one nadal oporne, co potwierdza hipotezę, że oporność na albendazol u H. contortus nie jest mediowana przez pojedynczy gen, ale wynika z współdziałania wielu genów. Efekt RNAi był mniej wyraźny w jajach niż w L3, potencjalnie ze względu na właściwości strukturalne skorupki jaja, które mogą ograniczać penetrację roztworu interferencyjnego.

Badanie to dostarcza nowych informacji na temat molekularnych podstaw oporności na leki przeciwpasożytnicze i sugeruje, że oporność H. contortus może wynikać z kombinacji adaptacji metabolicznych, mechanizmów wypływu leków oraz zmian w szlakach sygnalizacyjnych. Potencjalne zastosowania tych odkryć obejmują rozwój nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na GCY-12 lub powiązane szlaki sygnalizacyjne w celu przywrócenia wrażliwości na leki w opornych populacjach pasożytów.

Ekspresja GCY-12 może również służyć jako biomarker do monitorowania oporności H. contortus w populacjach pastwiskowych, umożliwiając podejmowanie świadomych decyzji dotyczących wyboru leków i schematów leczenia, co ostatecznie może poprawić zrównoważony charakter strategii kontroli pasożytów u małych przeżuwaczy. Dalsze badania powinny koncentrować się na identyfikacji docelowych cząsteczek GCY-12 poprzez analizy wieloomiczne oraz przeprowadzenie badań knockout lub nadekspresji genów na powiązanych genach w celu wyjaśnienia jego roli w szlakach odpowiedzi na leki.

Podsumowanie

Badania przeprowadzone na opornych i wrażliwych szczepach Haemonchus contortus, groźnego pasożyta małych przeżuwaczy, ujawniły istotną rolę genu GCY-12 w rozwoju oporności na albendazol. Gen ten, wykazujący najwyższy poziom nadekspresji w szczepach opornych, jest związany ze szlakiem sygnałowym cGMP i wpływa na mechanizmy odpowiedzi na stres u pasożyta. Wyciszenie GCY-12 techniką RNAi spowodowało znaczącą redukcję wartości EC50 o 70,86%, zwiększając skuteczność albendazolu. Odkrycie to sugeruje, że oporność H. contortus na leki wynika z kombinacji różnych mechanizmów, w tym adaptacji metabolicznych i zmian w szlakach sygnalizacyjnych. Ekspresja GCY-12 może służyć jako biomarker do monitorowania oporności pasożytów, co może przyczynić się do opracowania skuteczniejszych strategii terapeutycznych.