Albendazol w elastycznych cerosomach ze stearyloaminą jako obiecująca strategia w terapii przeciwnowotworowej
Czy repurposing leków zmienia paradygmat leczenia onkologicznego?
Nowotwory stanowią jeden z głównych problemów zdrowia publicznego na świecie, zajmując czołowe miejsca wśród przyczyn zgonów. Charakteryzują się nieprawidłową proliferacją komórek oraz zaburzeniami regulacji cyklu komórkowego i apoptozy. Pomimo rozwoju ukierunkowanych terapii przeciwnowotworowych, wskaźniki przeżycia pacjentów pozostają niskie z powodu szybkiego rozwoju oporności na leki, słabej waskularyzacji i hipoksji komórek nowotworowych. Istnieje zatem silna potrzeba opracowania nowych terapeutyków przeciwnowotworowych, które mogą przezwyciężyć oporność na leki i zapobiec przerzutom.
Opracowanie nowych leków przeciwnowotworowych wymaga wielu testów farmakologicznych, badań przedklinicznych i klinicznych, co wiąże się z wysokimi kosztami i długim czasem rozwoju. W tym kontekście repurposing leków (czyli ich reprofilowanie) został uznany za obiecującą strategię odkrywania alternatywnych zastosowań terapeutycznych dla leków będących już w użyciu klinicznym. Jest to atrakcyjna alternatywa w dziedzinie rozwoju leków, pozwalająca na ominięcie złożonych etapów i znacznych kosztów związanych ze standardowym opracowywaniem leków. Repurposing istniejących leków o znanym profilu farmakologicznym daje lepsze zrozumienie ich farmakodynamiki, farmakokinetyki i profili metabolicznych. W ostatnich latach repurposing leków w leczeniu nowotworów przyciąga uwagę jako sposób na uniknięcie dobrze znanych problemów związanych z opornością na leki oraz na dostosowanie planów leczenia minimalizujących działania niepożądane u pacjentów z chorobą nowotworową.
Jak działa Albendazol jako lek przeciwnowotworowy?
Albendazol (ALB) należy do benzimidazolowych leków przeciwpasożytniczych działających poprzez hamowanie polimeryzacji mikrotubul przez niszczenie struktury β-tubuliny. Powoduje również wyczerpanie zapasów glikogenu i obniżenie produkcji ATP u podatnych pasożytów poprzez blokowanie pobierania glukozy. W rezultacie przyczynia się do unieruchomienia i śmierci robaków. Ze względu na interakcję z mikrotubulami, ALB ostatnio wykazuje duży potencjał jako reprofilowany lek przeciwnowotworowy. Jego przeciwnowotworowa skuteczność jest wzmocniona przez inne mechanizmy, w tym: hamowanie przerzutów, indukcję apoptozy i zatrzymanie cyklu komórkowego. Ponadto ALB może uwrażliwiać komórki nowotworowe na promieniowanie jonizujące, co wskazuje na jego potencjalne zastosowanie w przerzutach do mózgu w połączeniu z radioterapią. Według doniesień jest skuteczny przeciwko szerokiej gamie komórek nowotworowych, np. komórkom raka prostaty, raka jajnika, raka jelita grubego i raka wątrobowokomórkowego.
W ostatnich latach rak piersi stał się jednym z najczęstszych nowotworów wśród kobiet na całym świecie. Strategie terapeutyczne raka piersi opierają się na chirurgii, radioterapii i chemioterapii. Obecnie dostępne leki przeciwko rakowi piersi są bardzo kosztowne i wykazują niską skuteczność oraz wysoką toksyczność, z wysokim odsetkiem progresji i nawrotów nowotworów. Ponadto problemy z sercem, bezpłodność, zakrzepy krwi i utrata masy kostnej są częstymi skutkami ubocznymi leków przeciwko rakowi piersi, które są trudne do zniesienia przez pacjentów chorych na raka. W związku z tym wykorzystanie ALB jako repurposed leku na raka piersi powinno być obiecującym rozwiązaniem dla obejścia tych problemów. Jednak ALB, będący związkiem klasy II BCS (rozpuszczalność w wodzie 0,2 μg/mL), ma ograniczoną ekspozycję ogólnoustrojową i zmienną biodostępność po podaniu doustnym. Dlatego słaba rozpuszczalność w wodzie i biodostępność po podaniu doustnym (mniej niż 5%) są uważane za przeszkody w klinicznym stosowaniu ALB jako leku przeciwnowotworowego.
Kluczowe zalety reprofilowania Albendazolu:
- Znany profil bezpieczeństwa i działania farmakologicznego leku
- Znacznie niższe koszty i krótszy czas wprowadzenia do terapii w porównaniu z nowymi lekami
- Potwierdzone działanie przeciwnowotworowe poprzez:
– hamowanie polimeryzacji mikrotubul
– indukcję apoptozy
– zatrzymanie cyklu komórkowego
– hamowanie przerzutów - Skuteczność wobec różnych typów nowotworów (rak prostaty, jajnika, jelita grubego, wątroby)
Czy nanoformulacje mogą przełamać bariery biodostępności ALB?
Przeprowadzono szereg badań mających na celu poprawę rozpuszczalności ALB w wodzie poprzez sformułowanie go jako nanocząstek lipidowych, nanocząstek chitozan-PLGA, nanocząstek albuminowych czy nanocząstek poliuretanowych, które wykazały obiecujące wyniki na różnych liniach komórek nowotworowych. Wykorzystanie zaawansowanych topicznych nanoformulacji ALB, np. kubosomów i ufasomów, jest uważane za utalentowane podejście do ominięcia słabej biodostępności doustnej ALB i zwiększenia jego przenikania i retencji w skórze.
Ostatnio badania koncentrują się na opracowaniu cerosomów (pęcherzyków tubularnych na bazie ceramidu) przy użyciu fosfolipidów i różnych surfaktantów (SAA). Ceramidy są głównymi składnikami w szlaku biosyntezy sfingolipidów o różnorodnych działaniach hamujących guzy. Dlatego wykorzystanie ceramidów w leczeniu raka jest uważane za kluczowy cel badań i interwencji. Włączenie surfaktantów do formulacji cerosomów mogłoby zwiększyć stabilność pęcherzykową i przedłużyć ich trwałość, co w konsekwencji zwiększa skuteczność leku. Różni badacze wykorzystali ceramid VI, fosfolipidy i różne SAA do skutecznego leczenia łuszczycy przy użyciu tazarotenu. Ponadto wykorzystano PEGylowane cerosomy i cerosomy wzbogacone kwasem hialuronowym do zwiększenia dostarczania do skóry fentikonazolu i spironolaktonu. Do chwili obecnej nie badano jeszcze cerosomów modyfikowanych poloksamerami. Poloksamery (Pluronics) są amfifilowymi kopolimerami triblokowymi, które po włączeniu do pęcherzyków fosfolipidowych mogą działać jako stabilizatory pęcherzyków, poprawiać właściwości mikromechaniczne dwuwarstwy pęcherzykowej, a w konsekwencji przedłużać szybkość uwalniania leku z pęcherzyków.
Ze względu na szybki podział komórek i akumulację nadmiernej ilości kwasu mlekowego, powierzchnia komórek nowotworowych wykazała znacznie wyższy ładunek ujemny niż normalne tkanki. Dlatego wykorzystanie nanonośników z ładunkiem dodatnim powinno selektywnie celować w komórki nowotworowe, odróżniając je od normalnych tkanek.
Jakie cele przyświecały badaniom nad SA-EC-ALB?
W związku z powyższym, celem przeprowadzonych badań było osiągnięcie dwóch głównych celów: po pierwsze, sformułowanie ALB jako repurposed leku przeciwnowotworowego w postaci elastycznych cerosomów (EC) (ALB-EC) – rodzaju elastycznych nanonośników na bazie lipidów, przy użyciu różnych Pluronics o różnej hydrofilowości zgodnie z projektowaniem D-optimal przy pomocy oprogramowania Design-Expert®, aby zbadać wpływ różnych zmiennych na charakterystykę pęcherzykową i zasugerować optymalny EC-ALB w oparciu o funkcję pożądalności. Po drugie, zbadanie wpływu włączenia lipidów o ładunku dodatnim (SA) na fizykochemiczne właściwości cerosomów. EC-ALB został wykorzystany jako jądro do sformułowania elastycznych cerosomów ze stearyloaminą załadowanych albendazolem (SA-EC-ALB) przy użyciu różnych ilości SA. Optymalna ilość SA została następnie wybrana i wykorzystana do przygotowania SA-EC-ALB, który został następnie oceniony pod względem morfologii za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Przeprowadzono również badanie in silico w celu przewidzenia interakcji między ALB a innymi składnikami w różnych mediach. Wreszcie, przeprowadzono in vivo ocenę objętości guza (TV) i badania histopatologiczne u dorosłych samców myszy Swiss albino przy użyciu modelu litego guza Ehrlicha, mające na celu zbadanie zarówno potencjału hamującego guz, jak i charakterystyki bezpieczeństwa formulacji SA-EC-ALB.
Jak przygotowano i scharakteryzowano elastyczne cerosomy z ALB?
Elastyczne cerosomy załadowane Albendazolem (EC-ALB) zostały opracowane przy użyciu techniki hydratacji cienkiego filmu. Krótko mówiąc, ALB (2 mg), PC (100 mg) wraz ze zmiennymi ilościami Pluronics (L121 lub P188) i ceramidów (III lub IIIB) zważono i rozpuszczono w 10 mL chloroformu w kolbie okrągłodennej (250 mL). Rozpuszczalnik organiczny odparowano pod próżnią za pomocą wyparki obrotowej (Rotavapor, Heidolph VV 2000, Burladingen, Niemcy), która obracała się przez 30 minut z prędkością 90 obr/min i temperaturze 60°C. Następnie 10 mL ultra-czystej wody destylowanej użyto do nawodnienia powstałego przezroczystego filmu przez 45 minut w temperaturze 60°C pod normalnym ciśnieniem. W celu uniknięcia agregacji, powstałe dyspersje elastycznych cerosomów poddano różnym czasom sonikacji (10, 20 lub 30 min) w temperaturze 25°C przy użyciu łaźni ultradźwiękowej.
Do oceny indywidualnych i łącznych efektów zmiennych formulacyjnych na charakterystykę nanosystemów, formulacje EC-ALB przygotowano przy użyciu projektu D-optimal wygenerowanego przez oprogramowanie Design-Expert®. Łącznie przygotowano 19 formulacji zgodnie z projektem eksperymentalnym. Zmiennymi niezależnymi były ilość SAA (X1), czas sonikacji (X2), typ ceramidu (X3) i typ SAA (X4), natomiast zmiennymi zależnymi były wydajność enkapsulacji (EE%; Y1), wielkość cząstek (PS; Y2) i wskaźnik polidyspersyjności (PDI; Y3).
Do określenia EE% EC-ALB wybrano metodę wirowania. W skrócie, 1 mL wytworzonej dyspersji wirowano przez 1 godzinę z prędkością 20 000 obr/min w temperaturze 4°C przy użyciu wirówki ultrachłodzącej. Następnie stężenie uwięzionego ALB określono spektrofotometrycznie po zlizie powstałego osadu za pomocą metanolu i analizie przy wcześniej ustalonym ALB λmax w metanolu (295 nm).
Dynamiczne rozpraszanie światła zaimplementowane w Zetasizer Nano ZS zostało użyte do określenia średniej PS, PDI i ZP przygotowanych EC-ALB. Przed każdym pomiarem, de-jonizowaną wodę używano do wystarczającego rozcieńczenia wytworzonych dyspersji, aż stały się mętne przed analizą, aby uzyskać odpowiednią intensywność rozpraszania.
Jedną z najważniejszych zalet projektu D-optimal jest przewidywanie optymalnych warunków przygotowania najlepszej formuły, która może nie być zawarta w rzeczywistym projekcie. Maksymalizacja EE% i minimalizacja PS i PDI były wybranymi kryteriami do przygotowania optymalnej formulacji EC-ALB. Stosując funkcję pożądalności, zasugerowano optymalną formulację, wyprodukowano, scharakteryzowano in vitro, a wyniki porównano z przewidywanymi odpowiedziami oprogramowania. Przewidywany optymalny EC-ALB został również użyty do dalszych badań.
Formulację SA-EC-ALB przygotowano przy użyciu tych samych składników co optymalny EC-ALB wraz z różnymi ilościami SA (5, 10, 15 mg). Formulację wyprodukowano przy użyciu tej samej techniki hydratacji cienkiego filmu zastosowanej do wytworzenia EC-ALB, a SA również rozpuszczono w chloroformie. Przygotowane formulacje SA-EC-ALB oceniono pod kątem EE%, PS i ZP. Wyniki przeanalizowano statystycznie przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA w oprogramowaniu SPSS, a następnie testu post-hoc Tukey’a HSD. Wartość p mniejsza niż 0,05 była uważana za statystycznie istotną. Optymalną koncentrację SA wybrano do przygotowania SA-EC-ALB, a następnie poddano dalszym badaniom in vitro i in vivo.
Całkowitą ilość uwolnionego leku po 6 godzinach (Q6h) obliczono przy użyciu aparatu do badania rozpuszczalności wg Farmakopei Amerykańskiej (USP) przez 6 godzin w temperaturze 37°C. Próbki o objętości 2 mL z SA-EC-ALB, EC-ALB i zawiesiny wodnej ALB (każda zawierająca 200 μg ALB) zamknięto w cylindrycznej plastikowej rurce (3,14 cm² obszaru permeacji). Jeden koniec tych rurek z jednym końcem bezpiecznie zamkniętym membraną celulozową, podczas gdy drugi połączony z wałami aparatu do badania rozpuszczalności USP zamiast koszy. Formulacje zanurzono w 50 mL roztworu buforowego o pH 7,4 (aby utrzymać warunki sink). Po 1, 2, 3, 4, 5 i 6 godzinach pobierano próbki (3 mL) i analizowano na obecność ALB za pomocą spektrofotometru UV przy λmax 295 nm. W celu zachowania warunków sink, natychmiast dodawano równoważną objętość świeżego medium uwalniania. Eksperyment powtórzono trzykrotnie.
SA-EC-ALB został morfologicznie zbadany przez TEM. Na siatce miedzianej pokrytej węglem umieszczono jedną kroplę dyspersji SA-EC-ALB jako cienką warstwę po zabarwieniu 2% w/v kwasem fosfowolframowym. Po wysuszeniu, próbkę analizowano przy użyciu TEM przy 80 KV.
ALB i optymalny SA-EC-ALB poddano badaniu termicznemu przy użyciu różnicowego kalorymetru skaningowego, który został skalibrowany za pomocą 99,9% oczyszczonego indu. Każdą próbkę (około 5 mg) umieszczono w konwencjonalnym aluminiowym naczyniu i ogrzewano między 10°C a 300°C z szybkością skanowania 10°C/min i ciągłym tempem przepływu azotu 25 mL/min.
Analizę obliczeniową przeprowadzono w warunkach próżniowych przy użyciu oprogramowania AutoDock. Lek i dodatki do formulacji zostały utworzone w dwóch wymiarach przy użyciu izomerycznych SMILES, które zostały zdeponowane w bazie danych PubChem. Struktury przekształcono w konformacje trójwymiarowe i zminimalizowano energię w polu siłowym AMBER ze zmodyfikowanym ładunkiem częściowym. Dokowanie molekularne przeprowadzono przy użyciu algorytmu genetycznego Lamarcka z polem siłowym AMBER w celu przewidzenia konformacji wiązania.
Najważniejsze osiągnięcia nowej formulacji SA-EC-ALB:
- Wysoka wydajność enkapsulacji leku (do 94%)
- Optymalna wielkość nanocząstek (273-740 nm) zapewniająca efektywne dostarczanie
- Znacząco zwiększona biodostępność w porównaniu z czystym albendazolem
- Potwierdzona skuteczność przeciwnowotworowa in vivo:
– istotne zmniejszenie objętości guza
– mniejsze uszkodzenia okolicznych tkanek
– lepsza selektywność działania - Stabilność i przedłużone uwalnianie substancji czynnej
Jak zoptymalizowana formulacja wpływa na działanie przeciwnowotworowe?
Aktywność przeciwnowotworową SA-EC-ALB oceniono w modelu litego guza Ehrlicha przy użyciu dorosłych samców myszy Swiss albino (n = 6) o średniej wadze 22 ± 2 g. Wielkość grupy sześciu myszy na grupę leczenia została określona na podstawie względów etycznych zgodnych z zasadą 3R (Zastąpienie, Redukcja, Udoskonalenie), mając na celu minimalizację użycia zwierząt przy jednoczesnym zapewnieniu ważności naukowej. Myszy trzymano w klatkach polipropylenowych w zwierzętarni Wydziału Farmacji Uniwersytetu w Beni-Suef, w okresie światła 12 godzin/dzień i w temperaturze 25°C ± 2°C oraz wilgotności 50% ± 5%. Myszy losowo podzielono na cztery grupy. Protokoły badań były zgodne z zaleceniami Przewodnika Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącego Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych (Publikacja NIH nr 8023, zrewidowana w 1978 r.). Nie wymagano zgody właścicieli zwierząt, ponieważ badanie dotyczyło myszy laboratoryjnych. Grupa (1) była normalną grupą kontrolną i otrzymała dootrzewnowo (I.P) roztwór nośnika. Grupy (2-4) otrzymały linię komórkową raka Ehrlicha (0,2 mL/2-2,5 × 10⁶ komórek/mysz) podskórnie do prawego uda każdej myszy w celu ustanowienia guza u myszy. Lity guz Ehrlicha u każdej myszy rozwinął się po 7 dniach. Grupa 2 służyła jako grupa kontrolna dodatnia, podczas gdy grupy 3 i 4 otrzymywały odpowiednio zawiesinę wodną ALB i SA-EC-ALB (100 μg/mL), w dawce 2 mg/kg (440 μL), I.P/3 dni/tydzień przez 3 tygodnie. Objętość guza (TV) określano za pomocą cyfrowego kalibratora na koniec każdego tygodnia, a po ostatnim dniu podawania leczenia wszystkie myszy znieczulono tiopentalem (30 mg/kg), a następnie uśmiercono przez dyslokację szyjną, a prawe uda wyizolowano do badania histopatologicznego.
Wyniki badań wykazały, że efektywność enkapsulacji (EE%) elastycznych cerosomów załadowanych Albendazolem (EC-ALB) wahała się od 66,52% ± 2,37% do 94,00% ± 3,58%. Zaobserwowano wyraźną interakcję między ilością SAA (X₁) a typem SAA (X₄). EC-ALB przygotowane przy użyciu niższej koncentracji Pluronic L121 (ilość SAA, X₁) wykazały wyższą EE% w porównaniu z tymi przygotowanymi przy użyciu wyższej koncentracji SAA. Z drugiej strony, pęcherzyki na bazie Pluronic P188 wykazały zwiększoną EE% poprzez zwiększenie ilości Pluronic P188. Mogło to być związane z wyższą hydrofilowością Pluronic P188 (HLB = 29) w porównaniu do L121 (HLB = 1).
W odniesieniu do czasu sonikacji (X₂), wyniki ANOVA wykazały, że EE% EC-ALB przygotowanych przy użyciu czasu sonikacji 10 i 30 minut było znacznie niższe niż tych przygotowanych przy użyciu pośrednich okresów sonikacji (15 i 20 minut). Innymi słowy, zauważono, że EE% stopniowo wzrastało wraz ze zwiększaniem czasu sonikacji z 10 do 20 minut. Może to być przypisane temu, że zwiększając czas sonikacji w odpowiednim zakresie, liczba pęcherzyków na jednostkę objętości wzrosła, co w konsekwencji zwiększyło hydrofobowe otoczenie dwuwarstwy lipidowej, aby włączyć więcej hydrofobowego leku (ALB), co w rezultacie zwiększyło EE%.
Wartości wielkości cząstek (PS) wszystkich EC-ALB mieściły się w zakresie nano (273,9 ± 7,90 do 740 ± 16,66 nm). Na PS EC-ALB znacząco wpłynęły ilość SAA (X₁), typ ceramidu (X₃) i typ SAA (X₄). W odniesieniu do ilości SAA (X₁), wyraźnie zauważono, że średnica przygotowanych EC-ALB znacznie zmniejszyła się przy początkowym zwiększeniu ilości SAA z 50 do 62,5 mg. Można to wytłumaczyć zdolnością SAA na wyższych poziomach do zmniejszania napięcia międzyfazowego przygotowanego nanosystemu i zwiększania krzywizny pęcherzykowej, co w rezultacie zmniejsza PS.
W odniesieniu do typu ceramidu (X₃), cerosomy pochodne ceramidu III miały znacznie większą średnicę niż te przygotowane przy użyciu ceramidu IIIB. Główna różnica między oboma ceramidami polega na tym, że ceramid IIIB ma jedno wiązanie nienasycone w swoim łańcuchu kwasu tłuszczowego i ma niższą masę cząsteczkową (581,95) w porównaniu do ceramidu III (583,98).
Biorąc pod uwagę typ SAA (X₄), wyniki ANOVA wykazały również, że EC-ALB przygotowane przy użyciu Pluronic P188 były znacznie większe niż te przygotowane przy użyciu Pluronic L121. Można to wytłumaczyć na podstawie wyższej hydrofilowości Pluronic P188 w porównaniu do L121, co w konsekwencji zwiększa pobieranie wody i powoduje powiększenie PS.
Wartości wskaźnika polidyspersyjności (PDI) EC-ALB wahały się od 0,40 ± 0,12 do 0,81 ± 0,12. Wszystkie cztery zmienne znacząco wpłynęły na PDI EC-ALB (P = 0,010 dla ilości SAA, 0,0003 dla czasu sonikacji, 0,0016 dla typu ceramidu i 0,0005 dla typu SAA). Wszystkie przygotowane formulacje miały ładunek ujemny i wahały się od -11,60 ± 0,01 do -26,30 ± 0,70 mV.
Całkowita pożądalność optymalnego EC-ALB wynosiła 0,862 i zaproponowano przygotowanie go przy użyciu ceramidu III (15 mg) i 50 mg Pluronic L121 z czasem sonikacji 19,41 min. Formulacja została przygotowana i oceniona. Wykazano małą różnicę między obserwowanymi a przewidywanymi odpowiedziami optymalnego EC-ALB, co potwierdziło racjonalność procesu optymalizacji. W związku z tym, optymalna formulacja EC-ALB została zagwarantowana do użycia jako jądro do przygotowania SA-EC-ALB.
Formulacje SA-EC-ALB zostały opracowane pod kątem EE%, PS i ZP i zbadane w celu określenia, jak induktory ładunku dodatniego wpływają na fizykochemiczne atrybuty EC-ALB. SA-EC-ALB przygotowane przy użyciu 5 mg SA wykazały znacznie wyższą EE% w porównaniu z tymi przygotowanymi przy użyciu większych ilości SA. Biorąc pod uwagę PS, SA-EC-ALB przygotowane przy użyciu 10 i 15 mg były znacznie większe niż 5 mg SA-EC-ALB. Cerosomy przygotowane przy użyciu 5 mg SAA wykazały wartości ZP wynoszące 38,2 ± 1,65 mV.
Profil uwalniania in vitro ALB z SA-EC-ALB i EC-ALB w porównaniu z zawiesiną wodną ALB pokazał, że szybkość uwalniania ALB z formulacji SA-EC-ALB i EC-ALB była znacznie wyższa w porównaniu z zawiesiną leku. Ponadto, ilość ALB uwolnionego z SA-EC-ALB i EC-ALB po 6 godzinach była znacznie wyższa niż z zawiesiny wodnej ALB. Wyższa szybkość i zakres uwalniania ALB z SA-EC-ALB w porównaniu z zawiesiną wodną ALB mogły być związane z solubilizacją ALB przez nośnik pęcherzykowy na bazie fosfolipidów. Powierzchniowo aktywne właściwości fosfolipidów są szeroko uznawane za zwiększające rozpuszczalność słabo rozpuszczalnego w wodzie leku zamkniętego w nich. Z drugiej strony, obecność SAA (Pluronic) może pomóc w tworzeniu miceli w dwuwarstwie, co w konsekwencji może zwiększyć przepuszczalność błony i zwiększyć uwalnianie leku.
Badanie transmisyjnym mikroskopem elektronowym wykazało, że SA-EC-ALB wykazał wydłużone włókna podobne do pęcherzyków. Czasami pojawiały się sferyczne pęcherzyki wraz z rurkowymi. Wydłużone włókna pojawiły się z powodu partycjonowania ceramidu do dwuwarstwy PC, co w konsekwencji spowodowało spłaszczenie krzywizny dwuwarstwy pęcherzykowej podczas przygotowania. Okazjonalne pojawianie się sferycznych pęcherzyków wraz z rurkowymi mogło być związane z nierównomiernym rozkładem ceramidu III w dwuwarstwach pęcherzykowych, co w konsekwencji spowodowało pojawienie się spłaszczonych domen bogatych w ceramid wraz ze sferycznymi, ubogimi w ceramid.
Badanie DSC wykazało, że ostry pik endotermiczny czystego ALB w temperaturze 204°C odpowiadający jego temperaturze topnienia zniknął w termogramie optymalnych elastycznych cerosomów ALB. Zniknięcie ostrego piku endotermicznego ALB w termogramie optymalnych elastycznych cerosomów ALB potwierdziło transformację ALB z formy krystalicznej do amorficznej z powodu jego całkowitej dyspersji w przygotowanym nanosystemie.
W badaniach molekularnego dokowania, ALB wykazał preferowaną orientację, wyrównując swój rdzeń aromatyczny w kierunku łańcuchów acylowych PC i pozycjonując go blisko grupy estrowej. Dalsza stabilność ALB-PC została podkreślona poprzez podwójną interakcję polarną między tlenem estru acylowego PC a atomami NH albendazolu pierścienia benzimidazolowego i podstawienia bocznego ramienia. Te wiązania wodorowe mieściły się w korzystnych parametrach geometrycznych, z odległościami 2,81 Å i 3,02 Å oraz kątami wiązania odpowiednio 134,20° i 122,30°.
System utrzymywał zrelaksowany i zrównoważony stan, na co wskazywały spójne profile energii kinetycznej i potencjalnej w okresie symulacji. Analiza konformacji w wyekstrahowanych przedziałach czasowych 200, 400, 600, 800 i 1000 ps wykazała stałą stabilność symulowanego kompleksu nanoformulacji ALB-PC, przy czym lek utrzymywał swoją pozycję w pobliżu łańcuchów acylowych fosfolipidów przez cały czas symulacji (RMSD < 2,00 Å). Ponadto ALB wykazał znacznie dużą ujemną energię swobodnego wiązania (średnia ΔG = -76,81 ± 4,2 kcal.mol⁻¹) w stosunku do składników formulacji, zapewniając wystarczającą stabilność kompleksu nanoformulacji.
Ocena mucoadhezji SA-EC-ALB wykazała, że ZP zawiesiny mucyny wynosiło -8,47 ± 0,13 mV i uległo zmianie po zmieszaniu z mucoadhezyjnym SA-EC-ALB. Mucoadhezyjny SA-EC-ALB wykazał przesunięcie od ujemnych wartości mucyny -8,47 ± 0,13 mV do dodatnich 15,00 ± 1,00 mV wartości ZP mucyny. Zespoły powstające z mucyny i SA-EC-ALB dały wartość dodatnią, co sugeruje, że dodatni ładunek SA-EC-ALB związany z powierzchnią mucyny zneutralizował jej ujemny ładunek. Wyniki dodatkowo wskazały, że składnik adhezyjny o właściwościach mucoadhezyjnych może zmieniać właściwości powierzchniowe mucyny.
W badaniach in vivo objętości guza (TV) różnych grup były mierzone w różnych odstępach czasu, na koniec pierwszego tygodnia (TV1), na koniec drugiego tygodnia (TV2) i wreszcie na koniec trzeciego tygodnia (TV3). W trzech punktach czasowych, grupa kontrolna Ehrlicha ujawniła wyraźne powiększenie objętości uda w porównaniu do normalnych myszy. W przypadku grupy leczonej zawiesiną wodną ALB, nie wykazały one istotnej różnicy w porównaniu z kontrolą Ehrlicha, z wyjątkiem końca trzeciego tygodnia (TV3), kiedy wykazały znaczące zmniejszenie TV w porównaniu do kontroli Ehrlicha. Co ciekawe, grupa leczona SA-EC-ALB wykazała znaczące zmniejszenie (P<0,05) TV w porównaniu z kontrolą Ehrlicha w trzech przedziałach czasowych.
Znaczące zmniejszenie TV w grupie leczonej SA-EC-ALB w porównaniu z kontrolą Ehrlicha wynika z wpływu Pluronics i SA na poprawę rozpuszczalności i retencji ALB. W związku z tym, więcej swobodnie rozpuszczalnego ALB byłoby dostępne do wywołania jego działania przeciwnowotworowego. Ponadto, obecność ceramidów w konstrukcjach pęcherzykowych synergistycznie zwiększyła skuteczność przeciwnowotworową SA-EC-ALB ze względu na zdolność ceramidów do indukowania niezliczonych szlaków sygnałowych hamujących guzy, np. autofagii, apoptozy i nekroptozy. Dlatego sformułowanie ALB w SA-EC-ALB z powodzeniem zwiększyło jego skuteczność przeciwnowotworową w porównaniu z wolną zawiesiną ALB.
Zastosowano półilościowy system oceny histopatologicznej do oceny nasilenia martwicy i infiltracji komórek zapalnych. Każdy parametr został oceniony w skali od 0 do 3, gdzie 0 = brak, 1 = łagodny, 2 = umiarkowany i 3 = ciężki. To podejście do oceny pozwoliło na porównawczą ocenę zmian patologicznych w różnych grupach leczenia.
Badanie histopatologiczne normalnych kontrolnych tkanek mięśniowych uda myszy wykazało normalną strukturę histologiczną pęczków mięśni prążkowanych z przestrzeniami między nimi (wynik: 0 dla wszystkich parametrów). Jednak myszy z kontroli Ehrlicha wykazały masową infiltrację komórek nowotworowych w tkankach mięśniowych w sposób ogniskowy i rozproszony. Zaobserwowano grupy pleomorficznych dużych okrągłych i wielokątnych komórek z hiperchromowymi jądrami i dwujądrowością (martwica: 1; zapalenie: 3). Myszy leczone zawiesiną wodną ALB wykazały znaczny stopień zmian nekrobiotycznych i atroficznych z umiarkowanym stanem zapalnym w komórkach guza Ehrlicha, włókna mięśniowe były nekrotyczne i zanikłe u większości myszy (martwica: 2; zapalenie: 2). Co ciekawe, pomimo znaczącej redukcji objętości guza obserwowanej in vivo, grupa SA-EC-ALB wykazała podobną infiltrację komórek nowotworowych z niewielkimi zmianami nekrobiotycznymi, a niektóre były zaangażowane we włókna mięśniowe (martwica: 1; zapalenie: 3).
Leczenie zawiesiną wodną ALB spowodowało znaczne zmiany nekrobiotyczne i atroficzne w komórkach guza Ehrlicha, wykazując znaczne działanie cytotoksyczne leczenia przeciwko komórkom nowotworowym, ale również doprowadziło do pewnych uszkodzeń tkanki mięśniowej. Natomiast myszy leczone SA-EC-ALB wykazały podobną infiltrację komórek nowotworowych, ale ze zmniejszonymi zmianami nekrobiotycznymi. Włókna mięśniowe wykazały mniej oznak atrofii. Sugeruje to, że SA-EC-ALB mógłby potencjalnie oferować bardziej zrównoważone podejście terapeutyczne, celując w komórki nowotworowe przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanki mięśniowej w większym stopniu.
Podsumowując, repurposing leków w leczeniu nowotworów jest preferowany w stosunku do opracowywania nowych leków ze względu na uniknięcie wysokich kosztów i długiego czasu przetwarzania. W prezentowanej pracy, ALB (repurposed lek przeciwnowotworowy) został sformułowany w elastycznych cerosomach przy użyciu techniki hydratacji cienkiego filmu zgodnie z projektowaniem D-optimal, aby zbadać wpływ zmiennych formulacyjnych na charakterystykę pęcherzykową i zasugerować optymalne elastyczne cerosomy załadowane Albendazolem (EC-ALB). Następnie wytworzono elastyczne cerosomy ze stearyloaminą (SA) poprzez włączenie różnych ilości SA do konstrukcji EC. SA-EC-ALB przygotowane przy użyciu 5 mg SA wykazały stosunkowo wysoką EE%, małą PS i akceptowalny ZP i zostały wybrane do dalszej charakterystyki. SA-EC-ALB wykazał znacznie wyższą szybkość i zakres uwalniania w porównaniu z zawiesiną wodną ALB. Ponadto, ocena przeciwnowotworowa przy użyciu guza Ehrlicha i badanie histopatologiczne potwierdziły zwiększony efekt przeciwnowotworowy ALB po włączeniu do SA-EC-ALB. Chociaż te wyniki sugerują potencjał zwiększonej wydajności terapeutycznej, wymagane są dalsze badania farmakokinetyczne i biodystrybucyjne, aby potwierdzić jakiekolwiek zwiększenie biodostępności ogólnoustrojowej. Dlatego SA-EC-ALB stanowi obiecujący nanonośnik do wzmocnienia potencjału przeciwnowotworowego ALB, w oczekiwaniu na dodatkową walidację.
Podsumowanie
Przedstawione badania koncentrują się na innowacyjnym podejściu do terapii przeciwnowotworowej poprzez wykorzystanie albendazolu (ALB) – leku przeciwpasożytniczego – w nowej formie nanonośnika. Naukowcy opracowali elastyczne cerosomy ze stearyloaminą (SA-EC-ALB), które znacząco poprawiły właściwości farmakologiczne albendazolu. Badania wykazały, że nowa formulacja charakteryzuje się wysoką wydajnością enkapsulacji (do 94%), odpowiednią wielkością nanocząstek (273-740 nm) oraz zwiększoną biodostępnością leku. W testach in vivo na mysim modelu guza Ehrlicha, SA-EC-ALB wykazał istotne działanie przeciwnowotworowe, skutecznie zmniejszając objętość guza przy jednoczesnym zachowaniu integralności okolicznych tkanek. Ta strategia reprofilowania leku w połączeniu z zaawansowaną technologią nośnikową może stanowić obiecującą alternatywę w terapii nowotworowej, oferując potencjalnie skuteczniejsze i bezpieczniejsze rozwiązanie terapeutyczne.
